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細胞的傳代培養
發布時間:2018-04-10   點擊次數:789次

 

貼壁細胞的傳代

所需材料

Ø 裝有貼壁細胞的培養容器

Ø 經過組織培養處理的培養瓶、培養板或培養皿

Ø 完全生長培養基,預熱至 37℃

Ø 一次性無菌15ml試管

Ø 37℃ 培養箱,充有二氧化碳濃度為 5% 的濕化空氣

Ø 平衡鹽溶液,例如:杜爾貝科磷酸鹽緩沖液 (DPBS),不含鈣、鎂和酚紅

Ø 消化酶,例如:胰蛋白酶,不含酚紅

貼壁細胞傳代流程

細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔,先用紫外燈和臭氧殺菌1h,然后通風30min,操作前需要換細胞間專用拖鞋,雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒,穿上實驗服,戴上一次性口罩和帽子,整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

1. 取對數生長期的貼壁細胞,棄掉舊培養基。

2. 用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞1-2遍。 (每10 cm2 培養表面積需要2 ml 溶液)。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液,以避免攪動細胞層,前后搖晃容器數次。

注:沖洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清、鈣和鎂。

3. 從培養容器中吸出沖洗液并丟棄。

4. 向培養瓶中加入預熱的消化酶(例如:胰蛋白酶);試劑量應足以覆蓋細胞層 (每10 cm2 大約0.5ml)。輕輕搖晃容器,使試劑完全覆蓋細胞層。

5. 將培養容器在室溫下孵育約2分鐘。

請注意,實際孵育時間根據所用細胞系不同可能有所差異。

6. 在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90%,可將孵育時間延長幾分鐘,每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養容器以加快細胞解離。

7. 細胞解離程度大于等于90%時,傾斜培養容器,使細胞上液體盡快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預熱完全生長培養基。輕柔吹打細胞層表面數次,使細胞分散,成為單細胞懸液。

8. 將細胞轉移到 15ml 離心管中,200g 離心5至10分鐘。

請注意,離心速度和時間依細胞種類不同而有所差異。

9. 用zui少體積的預熱完全生長培養基重新懸浮細胞沉淀。

注:此時可進行細胞計數

10.將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度,并將適量體積的細胞懸液轉移到新的細胞培養容器中,把細胞放回培養箱。

注:如果使用培養瓶,將其放入培養箱前應將瓶蓋旋松,以便進行充分的氣體交換,除非您使用的是通氣式培養瓶和透氣性瓶蓋。

懸浮細胞的傳代

懸浮細胞傳代比貼壁細胞傳代稍微簡單一些。由于細胞已經在生長培養基中懸浮,因此無需通過酶的作用使其從培養容器表面脫離,整個過程較為迅速,對細胞的損傷也較小。懸浮生長細胞的傳代培養要比貼壁細胞簡單得多,通常有兩種方法。

1.直接給帶傳代的培養瓶中補充一定量的新鮮培養基,然后將進行分裝。

2.先通過離心棄掉營養匱乏的舊培養基,然后再用適量的新鮮培養基重懸細胞沉淀,zui后將其分裝至培養瓶中即可。

懸浮細胞傳代后的延滯期一般比貼壁細胞短。

所需材料

• 裝有懸浮細胞的培養容器

• 完全生長培養基,預熱至37℃

37℃培養箱,充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣

懸浮細胞傳代流程

所有與細胞接觸的溶液和設備均應為無菌狀態。必須采用正確的無菌技術,并且在超凈臺內進行。傳代應在細胞處于對數期、未達到匯合狀態時進行。達到匯合狀態時,懸浮培養的細胞會聚集成團塊,轉動培養瓶時培養基會變得渾濁。傳代前所建議的zui大細胞密度隨細胞系不同而有所差異;詳細信息請參閱針對具體細胞的產品說明書或操作手冊。

懸浮細胞的傳代方法有2種

1、直接傳代法:

①待懸浮細胞長滿至80%-90%左右(細胞懸液變黃),即可傳代;

②用吸管吸棄細胞懸液1/2~2/3;

③加入適量的新鮮培養基,繼續培養。

2、離心傳代法:

①將細胞懸液轉移到離心管內;

②150g離心5min,棄上清;

③使用新鮮的培養基重懸細胞;

④吸管吸取適量細胞懸液,裝入新的培養瓶,再加入適量的新鮮培養基,繼續培養;

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