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用電熱恒溫培養箱做提蛋白及蛋白定量的濃度實驗
發布時間:2018-01-02   點擊次數:960次

1、吸棄培養皿中的培養液。 
2、往培養皿中加入2ml 冷的PBS輕輕蕩洗2~3次,zui后一次,吸干培養皿中的PBS。 
3、每個培養皿中加入70μl(以FLS細胞為例)裂解液。
裂解液的配置:
RIPA裂解液:蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物:RIPA裂解液(中)B液=100:1:1
(配置時實際配置的體積需比理論值高出幾十微升)
4、將加入裂解液的培養皿輕輕搖晃,使裂解液與貼壁細胞充分接觸,放入—70℃的冰箱,冷凍10分鐘。
5、裂解完后,用干凈的刮刀將細胞刮于培養皿的一處(動作要快,每個皿控制在3min),然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。(整個操作盡量在冰上進行)
6、將離心管置于小型離心機上渦旋一下,然后置于4℃冰箱放置30min。(期間從冰箱拿出再進行渦旋一次)
7、將離心管放入高速離心機,于4度下12000rpm 離心5min。(提前開離心機預冷)
8、取出離心管,吸取上清液,上清液即蛋白液,對其進行定量,轉移至新的1.5ml離心管。(定量需用的槍。)
9、對提取的上清液進行蛋白濃度的定量
蛋白定量的過程
①取干凈的96孔板,進行區域選擇板底掃描即讀板(切勿用手觸摸板底)
②首先在96孔板中加入18ul的PBS(做標準曲線的PBS)
③在18ul的PBS中加入2ul的樣品
④zui后在加入200ul的BCA(加入后的BCA不進行與樣品的混合,而是鋪在樣品的上面,用吹風機除去上方的氣泡)
         BCA的配置: BCA試劑A:BCA試劑B=50:1
⑤放置37°電熱恒溫培養箱孵育30min
⑥讀板(吸光光度值為562)
10、對剩余的樣品按照體積5:1的比例加入Loading Buffer(6X)
11、將加好的樣品放入離心機順離,使離心管內壁的樣品甩下。
12、將樣品放入恒溫金屬浴鍋中100℃煮7min
13、將煮好的蛋白放入—20℃冰箱中備用(在離心管壁上標記好樣品名稱、日期)

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