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細胞電轉染的步驟
發布時間:2018-12-03   點擊次數:162次

轉染是真核細胞主動或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。電擊完成后用恒溫培養箱進行測試也是很關鍵的步驟,下面給大家介紹下電轉染詳細步驟。

1.清洗電轉杯,將電轉杯置于75%酒精中浸泡2小時,然后在紫外燈下照射后即可使用。

2.電穿孔前一天,以合適密度傳代細胞,使細胞在轉染前出于對數生長期。對于原代培養細胞,一般培養2-3天后,細胞單層融合度可以達到70-80%,即可開始試驗。

3.PBS洗細胞2次后,胰酶消化細胞2min,待細胞變圓后,用完全培養基終止消化。

4.輕輕吹下細胞成單細胞懸液后,1200rpm室溫離心5min。

5.完全棄去上清,根據細胞數量,加入適量的電轉緩沖液重懸細胞(一般為0.5-0.6ml左右),并上下吹打均勻。

6.加入適量相應濃度的待轉染核酸至相應的終濃度(質粒為20ug/ml,SiRNA的終濃度為100nM),上下吹打均勻。若以0.5ml計算,所需質粒為0.5×20=10ug。

7.將含有相應濃度核酸的細胞懸液轉移入相應規格的電轉杯中,按照預定條件設置參數,進行電擊操作。

8.電擊完成后,將電轉杯置于恒溫培養箱中8-12min,以使核酸充分進入細胞。

9.將電擊杯從恒溫培養箱中取出,接種細胞懸液于預熱的培養基中,上下吹打均勻后,置于培養箱中正常培養。

10.正常培養4h,待細胞貼壁后,給細胞換新鮮的完全培養基,以去除上層的死細胞。

11.培養24h后,即可進行細胞轉染效率的檢測或是進行細胞的實驗處理。

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