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大腸桿菌轉化實驗
發布時間:2018-11-23   點擊次數:59次

大腸桿菌轉化實驗

下面喆圖小編為大家介紹使用恒溫培養箱做大腸桿菌轉化實驗。

大腸桿菌轉化:(1)將重組DNA分子導入大腸桿菌受體細胞進行復制,增殖和表達,以獲得目的基因;(2)驗證大腸桿菌感受態細胞效果;(3)用于分子生物學其他研究。 熱擊法:  實驗方法原理:質粒DNA或重組DNA粘附在細菌細胞表面,經過42°C短時間的熱擊處理,促進吸收DNA.然后在非選擇培養基中培養一代,待質粒上所帶的抗菌素基因表達,就可以在含抗菌素的培養基中生長。

實驗步驟:

一、實驗材料準備

1.  器材  旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5 ml 微量離心管,雙面微量離心管架,恒溫水浴鍋,制冰機,恒溫搖床,培養皿(已鋪好固體LB-Amp),超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養箱。

2.  試劑  培養基(不加抗菌素),LB培養基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal。 3.  材料處理  無菌ddH2O,1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。

二、操作步驟

1.  事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。

2.  從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100 μl)感受態菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10 min。

3.   加入5 μl 連接好的質粒混合液(DNA含量不超過100 ng),輕輕震蕩后放置冰上20 min。

4.  輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5 min。

5.  在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6.  在超凈工作臺中取上述轉化混合液100-300 μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

7.  如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal,8 μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

8.  在涂好的培養皿上做上標記,先放置在37℃恒溫培養箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養箱過夜。

9.  在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告。  10.  觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

注意事項:1.  玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂。

詳情可咨詢喆圖客服。(恒溫搖床恒溫水浴鍋恒溫培養箱

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