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菌種培養
發布時間:2018-10-12   點擊次數:109次

      在自然界里,食用菌都不是單獨存在的,而是和許多細菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所謂菌種分離,就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來,通過培養,獲得純的優良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。

     (一)母種的分離培養 食用菌母種的分離,可分為孢子分離法、組織分離法以及基內菌絲分離等。 1.孢子分離法 孢子分離法,是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發成菌絲,培養成菌種的方法。這種菌種生活力較強,但孢子個體之間有差異,且自然分化現象較嚴重,變異大,需經出菇試驗才能在生產上應用。

     (l)單孢分離法:是每次或每支試管只取一個擔孢子, 讓它萌發成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲,有結實能力,可采用此法分離生產純菌種。單孢分離生產上較少采用,而且技術復雜,一般采用多孢分離法。

     (2)多孢分離法:就是把許多孢子接種在同一培養基上,讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法,有以下幾種: ① 種菇孢子彈射法:選擇個體健壯、朵形圓正,無病蟲害、出菇均勻、高產穩產,適應性強的八九分成熟的種菇,切去大部分,菌柄用無菌水沖洗數遍后再用已滅菌的 紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分。在接種箱或無菌室內,把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面,漏斗倒蓋在培養皿上面;上端小孔用棉花塞住。培養皿放 在一個鋪有紗布的搪瓷盤上,靜置12~20小時,菌褶上的孢子就會散落在培養皿內。形成一層粉末狀孢子印(平菇極淡紫色,蘑菇、草菇 為褐色,香菇、金針菇孢子印白色)。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養皿上劃線接種。待孢子萌發,生成菌落時,選孢子萌發早、長勢好的菌落進行試管培養。 還可用孢子采集器收集孢子。方法是選好種菇后,按上述程序,輕輕掀開玻璃鐘罩,將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼絲架上,放在培養皿正中央。隨即蓋好玻璃罩,用紗布將鐘掌周圍塞好。并在紗布上倒少許 HgCl2或無菌水。移入 20℃左右恒溫培養。 ②褶上涂抹法:按無菌操作分離時;應選擇成熟的種菇,用接種針直接插入褶片之間,輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子,再在培養基上劃線接種。 ③鉤懸法:取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳〕,用無菌不銹鋼絲(或鐵絲、棉線等其他懸掛材料)懸掛于三角瓶內的培養基的上方,勿使接觸到培養基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養、轉接即可。 ④貼附法:按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊, 用溶化的瓊脂培養基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養基正上方的試管壁上。經6~12小時的培養,待孢子落在斜面上,立即把孢子連同部分瓊脂培養基移植到新的試管中培養即可。 孢子分離得到的母種、必須進一步提純復壯,當母種定植一星期左右,菌絲布滿斜面時,選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管,進而轉管擴大,一般到栽培種,轉管不宜超過5次。 孢子分離得到的母種,必須通過出菇試驗,鑒定為優質菌種后,才可供生產使用。 一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等,都可用多孢分離法獲得母種。 現就銀耳孢子分離略述于下: 按 無菌操作獲取種耳后,懸掛種耳的三角瓶經12小時培養后,瓶底培養基表面就有"孢子印"。取出種耳,置 20℃—25℃恒溫培養箱中培養2~3天,培養基表面會出現乳白色透明的糊狀小菌落,就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養基上, 待長滿斜面后,再移接入營養豐富,且表面比較干燥的培養基上。經30天左右,菌落長出白色菌絲。 銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌(香灰菌絲)混合培養時,由后者幫助分解木材及其他一些纖維物質,提供營養,才能利于銀耳孢子萌發,菌絲的定植和子實體的形成。  

     在兩種菌絲交會時,先選出兩種純菌絲。 羽毛狀菌絲要純化選育,一般要選取生長迅速,爬壁力強的試管斜面或種瓶,取先端菌絲,轉管移接,置25℃—28℃上培養,重復轉管幾次即可得到優良純種。 銀耳菌絲的特點,菌絲生長緩慢,擔孢子也不易萌發。在進行兩菌混合時,先取經8~IO天培養的銀耳菌絲斜面,按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5厘米處接入一 小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養1周即得到混合好的銀耳母種。 2.組織分離培養法 利用子實體內部組織,進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法,即組織分離。該法操作簡便,菌絲生長發育快,品種特性易保存下來,特別是雜交育種后,優良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩定下來。

      常采用以下分離方法。

     (l) 子實體分離:種菇要選朵大蓋厚,柄短,八九分成熟的優良品種。切去菇兩基部,在無菌箱內以0.1%的 HgCl2水浸幾分鐘,再用無菌水沖洗并揩干或用75%酒精 棉球擦拭菌蓋與菌柄2次,進行表面消毒。接種時,只要將種菇撕開,在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處,挑取一小塊組織;移接 到PDA培養基上。置25℃左右溫度下培養3-5天,就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲,轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。

     (2) 菌核分離:茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易采集。而常見的是它貯藏營養的菌核。用菌核分離,同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗凈,用酒精或 HgCl2消毒 后,切開菌核,取中間組織一小塊,約黃豆大小,接種在PDA 培養基斜面上,保溫培養。應注意的是,菌核是貯藏器官,大部分是多糖類物質,只含有少量的菌絲,因此挑取的組織塊要大一些,如果組織塊過小,則不易分出菌種。

     (3)菌素分離:有一部分子實體不易找到,也沒有菌核,可以用菌素進行分離。如蜜環菌、假蜜環菌。其操作方法是先用酒精或 HgCl2將菌素表面黑 色皮層輕輕擦拭2~3次, 然后去掉黑色外皮層(菌鞘),抽出白色菌髓部分;用無菌剪刀將菌髓剪一小段,接種在培養基上,保溫培養,即得該菌菌種。 菌素分離要注意:因菌素比較細小,分離素也比較細小,分離時極易污染雜菌,所以要嚴格操作。 3.基內菌絲分離培養法 利用食用菌生育的基質作為分離材料,來得到純菌種的一種方法,叫基內菌絲分離法。 此種分離方法是適宜只有在特定的季節才出現,而且是朝生暮死,不易采得的子實體。基內分離法與組織分離法不同之點是,干燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀 態。接種后有時并不立刻恢復生長。因此,有必要保留較長的時間(約1個月),以斷定菌絲是否能成活。基內菌絲分離法又可分為,材中菌絲分離(即菇木或耳木 分離法)及土中菌絲分離法等。

     (1)材中菌絲分離法:就是菇木或耳木分離法,為了減少雜菌的感染,菇(耳)木在分離之前,必須進行無菌處理。可 以把菇(耳)水表面用酒精燈火焰輕輕燒過,以燒死霉菌的孢子,或再用0.1%的 HgCl2水浸孢幾分鐘,然后用無菌水沖洗后用無菌濾紙吸干。接種塊切取時應注意。接種塊必須在該菌菌絲分布的范圍內切取。所以,菌絲生長緩慢的種類應淺取;菌種生長快的種類可以深取。同時。還應根據菇菌的種類、木材質地、菇(耳)木粗細、發育時間的長短來確定菌絲分布的范圍。然后用一把利刀進行切取。接種塊應盡量小些,以減少雜菌感染機會,提離菌種的純度。接種塊移到培養基上,就 應該放到適合菌絲生長的22℃~26℃ 的溫室或溫箱中培養,使菌絲恢復生長。

     (2)土中菌絲分離:食用菌種類很多,許多土生的食用菌;孢子不易萌發。組織分離也不易成功,用土中菌絲分離獲得純種的方法,叫土中菌絲分離。 土 中菌絲分離時要注意,由于土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物,因此分離時必須盡可能避開這些微生物的干擾,盡可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜 物的菌絲接種,反復用無菌水沖洗,在培養基中加入一些抑制細菌 生長的藥物,如40微克/升的鏈霉素或金霉素。如發現感染細菌,可以把菌落邊緣的菌絲挑出來,接種到木屑培養基中。因細菌沒有分解木質素的能力,因此在木屑培養基中不易擴展;只局限于接種處。待菌絲長出感染區后,就可以再進行擴大提純了。

     (3)子實體基部分離:從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基部分離出新菌絲的方法,叫子實體基部分離,現以袋栽銀耳為例說明:從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中;選擇生活力最頑強的幼耳5袋,移到氣候溫和,有散射光的野外場所進行后期培養,以增強菌絲體的生活力。經培養 7~10天后,待子實體直徑達4~5厘米時便可取回,作為分離的母體。再從中篩選最理想的一朵,用利刀割掉銀耳子實體,放置于 0℃的冰箱或有C6H6O4S的容器中過夜,以便殺死瓶中的害蟲。然后用75%酒精或HgCl2擦洗耳基和袋子外邊的雜質,連同接種工具、接種培養基等移進無菌室。經滅菌后,用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除,并進行培養。待袋口露出白色菌絲時,用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結體,迅速移入母種試管培養基 的中央,輕輕地脫去接種針, 塞上棉塞。 為了能夠獲得較多的母種,一次接種量要有100—200支試管,以便從中選擇。分離后應及時移入22℃—24℃恒溫箱或溫室中培養。由于培養基內水分較 多,菌絲恢復要比耳木分離得快。經2-3天后,分離物的邊緣就可看 到白色菌絲。每天要至少觀察兩次,以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔同。經適溫培養10-15天后,當接種塊扭結團出現紅、黃色水珠時,即可擴大原種。

     (二)原種和栽培種的接種培養

      母種獲得以后,為了滿足菌種生產的需要。應選出優良、純度高的母種進一步擴大為原種。 原種培養基一般采用棉籽殼、木屑、草類等培養基。

     瓶裝或袋裝的原種培養基滅菌后,可送入滅過菌的接種箱內,待瓶中的培養基冷至30℃以下,可按照無菌操作程序進行接種。 菌種瓶(袋)放入培養室時,要經常進行檢查,一經發現雜菌污染,立即取出。培養成的原種,菌絲體必須健壯有力,緊貼瓶壁而不干縮,顏色純正,具有一定清香味,生活力強,擴制成栽培種時吃料快。 栽培種就是將原種進一步擴大培養成三級種,它和原種的接種及培養相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養基。蘑菇多用糞草做培養料。 栽培種要求料塊不脫水干縮。菌絲體健壯有力、顏色純正,有清香味,無老化現象,無雜菌污染,有的種許可有少量原基,接入栽培料后,發菌快,長勢好,生活力強。原種在接栽培種時,原種瓶口的一層菌絲體應挖去不用。

     (三)液體種的簡單培養 目前,用液體深層發酵法生產菌種,具有生產量大、周期短、菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點,是實現食用菌工廠化生產的目標。現將液體種培育過程簡述于后,供參考。 簡言之就是將純正優良的菌種,接入液體培養基(固體培養基不加凝固劑),使菌絲繁殖形成大量小菌球,然后將這種培養基拌入木屑或棉籽皮料內,制成菌塊、培養其形成子實體。還可用于制原種、栽培種。 培養液體菌種,可將培養液裝入三角瓶中,約占空瓶的五分之一重量。用搖瓶機(也稱搖床)來培養。搖瓶機有旋轉式和往復式兩種,一般多用往復式。液體培養基可用馬鈴薯汁(加糖),麥芽汁配制,也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配制。可以混合培養基,因適用于多種食用菌和藥用菌的培養,均有好效果。組分:豆餅 粉2%, 玉米粉1%, 葡萄糖3%,酵母粉0.5%,磷酸二氫鉀0.1%,碳酸鈣 0.2%, pH自然, 12℃滅菌半小時。然后接種培養。 如果生產量較大,在三角瓶的基礎上,再逐級擴大種子缸,發酵罐中進行液體深層通氣發酵,產生大量菌種。但由于生產中要求設備繁多,技術性強,我們還應創造條件;實現食用菌栽培的現代化。

     (四)菌種質量的鑒定 菌種質量鑒定較為適合的方法是,做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時,或在菌種生產中,如何能知菌絲生長情況,快速判斷菌種質量?我們介紹幾種方法: 1.肉眼觀察:優良菌種菌絲濃白,絨狀,粗壯密集,生長整齊,速度快,香味濃厚。 2.優良菌種標準可歸納為:"純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時,打開瓶塞,從菌種瓶中部取出小塊菌絲體,觀察色澤,聞其氣味,手捏料塊檢查其含水量,看是否符合上述要求標準。 3. 顯微鏡檢查:挑取少量菌絲,置顯微鏡上觀察其形態,菌絲分枝,分隔情況,鎖狀聯合,細胞膜的厚薄。 培養觀察:從菌種瓶中挑取小塊菌絲體,接種斜面試管培養基上,置23℃~25℃恒溫中培養,經五周后檢查菌種生活力。如果菌絲生長快,旺盛純一,健壯濃 厚,長且整齊,則表示菌種的生活力強。 4.分塊法:在桌上放一張白紙,把菌齡相同的菌種從瓶內取出一大塊,用手分成2塊,再把2塊分成4塊,4塊 分成8塊,依次進行。優良菌種整塊多,碎渣少。劣次菌整塊少,碎渣多。 5.液體菌種鑒別:當三角瓶或發酵缸培養3-7天后,如液面出現氣泡,產生"油皮"、混濁等現象,說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮,或遲遲長出很薄的菌絲層,則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀,表明菌種生命力強。

     (五)菌種生產過程中的雜茵防治 在 生產菌種時,要時刻注意雜菌污染,以防為主,一旦發生,根治很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下進行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿,都 要進行嚴格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗,并穿戴消過毒的工作服、帽和口罩,動作要敏捷、準確,盡量不要講話走動,以防空氣中的雜菌感染。 分離母種時,選擇出菇早、生活力強,第一潮菇是關鍵,因它生活力強,接種后迅速占領陣地,無雜菌侵入的機會。 被污染的菌種,原因是多方面的,一般是滅菌不徹底所致,或因接種時無菌操作不嚴、瓶蓋不合適造成的。所以滅菌一定要徹底,建議在接種萌將培養基置25℃左右恒溫箱中做效果檢查,經2天不長雜菌,說明徹底,可以使用,接種過程中一定要嚴格無菌操作。 污染雜菌另一個原因可能是分離母種時感染雜菌,因種菇表面帶菌,消毒不徹底,通過組織塊將雜菌帶入培養基。 總之,污染機會很多,要注意環境消毒,按無菌操作規程徹底滅菌,層層把關,環環抓緊,嚴加注意;提離菌種質量。

     以上內容僅供參考,詳情請咨詢上海喆圖。

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