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菌種的培養
發布時間:2018-09-25   點擊次數:340次

人們采取無菌操作的方法,把某種食用菌從混雜的微生物中,單獨地分離開來,這個過程叫做菌種分離。從分離過程中得到的菌絲體純化后,就是純菌種。在實驗室條件下,以人工使純菌種大量生長和繁殖的方法,叫做培養。下面由小編帶大家了解一下,如何培養菌種。

1.1材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌。

1.1.2 培養基 (1)LB培養基:蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸餾水1000ml,pH為7,(可溶性淀粉20g)瓊脂20g。

(2)篩選用培養基:含有2%可溶性淀粉的LB培養基。 

(3)種子培養基:豆餅粉4%,玉米粉3%,Na2HPO40.8%,(NH4)2SO40.4%,NH4Cl0.15%,H2O。

(4)發酵培養基:豆餅粉5.6%,玉米粉7.2%,Na2HPO40.8%,(NH4)2SO40.4%, NH4Cl0.13%,CaCl20.13%,α—淀粉酶50g。

【2】 1.1.3 主要試劑

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麥芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、(Beef Extract)、尿素、氯化銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉和氯化鈣。

1.1.4 儀器設備

控溫搖床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測定儀、無菌操作臺和紫外分光光度計。

1.2方法

1.2.1 培養基的制備

(1)稱量

按培養基配比依次準確地稱取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入燒杯中,并在燒杯中加入少量蒸餾水。注:酵母膏常用玻棒挑取,放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶化后倒入燒杯,也可放在稱量紙上,稱量后直接放入水中,這時如稍微加熱,酵母膏便會與稱量紙分離,然后立即取出紙片。

(2)溶化

可溶性淀粉溶液的配制方法:將所需克數的可溶性淀粉放入一個小燒杯中,加入少量蒸餾水,攪拌成糊狀,然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養基總體積的沸水中,一邊攪拌一邊加熱,待其溶化成透明狀后繼續在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液。 如果配制固體培養基時,將已準備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中,將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中,再加熱溶化,補水到所需的總體積。在制備用三角瓶盛固體培養基時,一般也可先將一定量的液體培養基分裝于三角瓶中,然后按2%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中,不必加熱溶化,而是滅菌和加熱溶化同步進行,節省時間。 在瓊脂溶化過程中,應控制火力,以免培養基因沸騰而溢出容器。同時,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底燒焦。配制培養基時,不能用銅或鐵鍋加熱溶化,以免離子進入培養基中,影響細菌生長。  

(3)調pH 培養基配好以后,先用精密pH試紙測量培養基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培養基中逐滴加1mol/LNaOH,邊加邊攪拌,并隨時用pH試紙測其pH,直到pH達7為止;反之,用1mol/LHCl進行調節。 對于有些要求pH較精細的微生物,其pH的調節可用酸度計進行。 注意:pH不要調過頭,以避免回調而影響培養基內各離子的濃度,配制pH低的瓊脂培養基時,若預先調好pH并在高壓蒸汽下滅菌,則瓊脂因水解不能凝固,因此應將培養基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合,或在中性pH條件下滅菌,再調整pH。

(4)分裝 按照實驗要求,可將配置的培養基分裝入試管內或三角瓶中。 液體分裝:分裝的高度以試管高度的1/4左右為宜;分裝三角瓶的量則根據需要而定,一般以不超過三角瓶的一半為宜。 固體分裝:分裝于試管中的應不超過試管的1/5,滅菌后制成斜面;分裝三角瓶的量以不超過一半為宜。

(5)加塞 培養基分裝完畢后,在試管口上塞上棉塞,以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染,并保證有良好的通氣性能。

(6)包扎 加塞后,將全部試管用麻繩捆好,再在棉塞外包一層牛皮紙,以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞,外邊再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養基名稱,組別,配制日期。三角瓶加塞后,外包牛皮紙,用麻繩以活結扎好,使用時容易解開,同樣注明。

(7)滅菌 將配置好且包扎完畢的固體、液體培養基及本實驗涉及的試管、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa,121℃條件下高壓蒸汽滅菌20分鐘。

(8)斜面擱置 將培養基冷卻至50℃左右時放置斜面,斜面在試管的1/2處為宜,待斜面凝固后,放置于冰箱中待用。

1.2.2菌種的篩選與保藏

(1)倒平板 將實驗配制好的培養基加熱溶化,待冷卻至55—60℃時,倒平板9皿。

(2)稀釋 用接種環取菌種,放入盛90ml無菌水的三角瓶中,振搖。用一支1ml無菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻,然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中,混合均勻,以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的菌液。

(3)劃線  將平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5、10-6三種稀釋度(共三組)然后用接種環分別沾取濃度為10-4、10-5、10-6稀釋液并對號在相應平板上劃線,室溫下靜止5—10min,使菌液吸附進培養基。

(4)培養 將培養基平板倒置于37℃的培養箱中,培養2—3天,觀察淀粉圈。對有淀粉圈的菌落,測量淀粉圈的直徑D,菌落直徑r,計算D/r的比值,可進行拍照,選擇淀粉圈較大的菌落作為后續實驗的菌種。

(5)接種 接種到斜面培養基中,標注上日期等信息。放入恒溫培養箱中培養作為一級種子。

(6)保藏 斜面置于37℃的培養箱中,培養2—3天,觀察菌種長勢好壞,若菌種長勢好則將其放入冰箱中保藏,若長勢不好則需多次斜面轉接。

以上內容是由喆圖小編整理的方案,希望能給您帶來幫助;以上內容僅供參考,詳情請咨詢,上海喆圖。

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